Mit der Empfindlichkeit kann das Signal-Rausch-Verhältnis in einem Chromatogramm optimiert werden. Je nach Fluoreszenzintensität kann es notwendig sein, die Empfindlichkeit während einer Analyse mehrfach anzupassen. Für die Wahl der optimalen Empfindlichkeit müssen die maximal auftretenden Emissionsintensitäten in einem separaten Probenlauf ermittelt werden.
Empfindlichkeitseinstellung und Autoranging
Die Intensität des Emissionslichts nach dem Emissions-Monochromator wird mit einem oder zwei PMTs gemessen. Die Empfindlichkeit des PMT kann über die Einstellung Sensitivity in 8 Stufen (1 bis 8) angepasst werden. Mit jeder Stufe der Sensitivity wird die Empfindlichkeit der PMTs in etwa um den Faktor 2 größer. Hat ein Peak mit Sensitivity = 5 zum Beispiel eine Höhe von 15 Millionen Counts, dann vergrößert sich die Peakhöhe auf ca. 30 Millionen Counts, wenn mit Sensitivity = 6 gemessen wird.
Wird die Empfindlichkeit zu klein gewählt, kann aufgrund der zu geringen Peakhöhe kein optimales Signal-Rausch-Verhältnis mehr erreicht werden (siehe Abbildung, Sensitivity = 1).
Wird die Empfindlichkeit zu groß gewählt, dann geht das Signal des PMT in die Sättigung. Der Detektor schaltet in diesem Fall die Sensitivity automatisch zurück. Im Chromatogramm erscheinen zu Beginn und Ende des übersteuerten Bereichs Linien, die das Umschalten markieren (siehe Abbildung, Sensitivity = 8). Ist der Detektor nicht mehr übersteuert, wird die Sensitivity-Einstellung vor der Sättigung wiederhergestellt.
TIPP
Im Chromeleon Audit Trail erscheint bei einer automatischen Reduzierung der Empfindlichkeit sowie bei der Wiederherstellung des Ursprungswertes eine Warnung, die den Wert der Empfindlichkeit nach der automatischen Anpassung angibt.
Beim Vanquish Fluoreszenz-Detektor wird die vom PMT gemessene Intensität des Emissionslichts auf die (von dem Referenzsensor gemessene) Bestrahlungsintensität der Probe normiert. Deshalb können die vom Emissionskanal angezeigten Werte (Counts) nicht direkt für die Optimierung der Empfindlichkeit verwendet werden. In der Abbildung erreicht der PMT bei 63 Millionen (normierten) Counts die Sättigung. Unter anderen Messbedingungen kann die Sättigung aber auch erst bei einem Wert von z.B. 100 Millionen Counts eintreten.
Verwenden Sie daher zur Optimierung der Empfindlichkeit den Parameter MaxPMTSaturation für jeden Peak wie unten beschrieben. Dieser zeichnet kontinuierlich die größte am PMT aufgetretene Aussteuerung in Prozent vom Sättigungswert auf seit dem letzten Chromeleon-Befehl ClearMaxPMTSaturation. Das Ergebnis wird aufgezeichnet in Prozent der maximal erlaubten PMT-Sättigung.
Bestimmung der optimalen Empfindlichkeit
Bestimmen Sie die optimale Empfindlichkeit in einem separaten Probenlauf, nachdem Sie die optimalen Wellenlängen wie unten beschrieben bestimmt haben.
Verwenden Sie dazu eine Probe (Standard) mit der maximal zu erwartenden Konzentration der Analyten.
Wählen Sie eine Empfindlichkeit, bei welcher noch keine Übersteuerung erwartet wird (zum Beispiel 1 oder 2).
Haben die einzelnen Peaks in einem Chromatogramm sehr unterschiedliche Höhen, dann kann das Signal-Rausch-Verhältnis der kleinen Peaks durch eine zeitgesteuerte Umschaltung der Empfindlichkeit während des Laufs zwischen den Peaks verbessert werden mit Hilfe einer Timetable.
Nehmen Sie immer die gleiche PMT-Einstellung, um die Empfindlichkeit für die Analyse zu bestimmen.
Ein Beispiel für eine Instrumentenmethode finden Sie in der Chromeleon-Hilfe.
Gehen Sie wie folgt vor
Öffnen Sie die zu optimierende Methode in dem Script Editor. Die notwendigen Befehle müssen manuell in der Methode eingefügt werden.
Fügen Sie einen Chromeleon-Befehl ClearMaxPMTSaturation zu Beginn des Laufs hinzu.
Fügen Sie nach dem Peakmaximum eines erwarteten Peaks (oder einer Gruppe von Peaks) einen Log-Befehl für das Property MaxPMTSaturation ein, um den maximalen Sättigungswert zu diesem Zeitpunkt in den Audit Trail zu schreiben (siehe Abbildung unten).
Fügen Sie einen ClearMaxPMTSaturation-Befehl kurz danach ein, vor der Elution des nächsten Peaks, um den MaxPMTSaturation-Wert auf null zurück zu stellen (siehe Abbildung unten).
Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 für alle Peaks.
Messen Sie eine Probe und lesen Sie die Werte für MaxPMTSaturation in der Software Chromeleon ab und werten Sie diese aus:
Wert | Was ist zu tun... |
|---|---|
< 30% | Die Empfindlichkeit sollte erhöht werden. Als grobe Richtlinie gilt: Wiederholen Sie dann die Optimierung ab Schritt 1. |
30% - 80% | Die Empfindlichkeit ist optimal eingestellt. |
80% - 99% | Die Empfindlichkeit sollte um eine Stufe reduziert werden, um eine unbeabsichtigte Übersteuerung bei Schwankungen der Konzentration zu vermeiden. |
≥ 100% | Die Empfindlichkeit sollte um mindestens eine Stufe reduziert werden. In den meisten Fällen hat der Detektor die Sensitivity bereits automatisch reduziert ("Autoranging"). Sehen sie im Audit-Trail nach und wiederholen Sie mit der dort angegebenen kleinsten Empfindlichkeit nach dem letzten Autoranging die Optimierung ab Schritt 1. |
Sind die maximal zu erwartenden Konzentrationen der Analyten nicht bekannt, so sollte die Empfindlichkeit bereits bei kleineren Werten von MaxPMTSaturation reduziert werden.
TIPP